西川 東チームの発表《Journal of the International College of Dentistry の》の研究ストレプトキサンチン（STZ）糖尿病ラットモデルの構築を誘導し、このモデルで実験的歯周炎を誘導し、一酸化窒素（いいえ）通路は重点、糖尿病状態における歯周病悪化の機序を探究し、歯肉血流、炎症関連遺伝子（腫瘍壊死因子α/TNF-α誘導型一酸化窒素合成酵素／iNOS）発現及びニトロソストレスマーカー（ニトロチロシン）の変化。

要約

〈目的〉糖尿病状態における歯周病の悪化の機序を明らかにするために、本研究はストレプトキサンチン（STZ）糖尿病ラットモデルの構築を誘導し、このモデルで実験的歯周炎を誘導し、一酸化窒素（いいえ）通路は重点検討を展開する。

〈材料と方法〉対 5 周齢雄SDラット、腹腔内注射によるSTZ（60mg/kg）糖尿病を誘導する。STZしゃしゅつ2 周後、上顎右側第二臼歯（M2 の）の歯頚部結紮ナイロン糸（3-0スールクアラルンプール）実験性歯周炎を誘導し、この側を実験側とする、反対側は対照側として処理を行わない。実験的歯周炎誘導2 週後、まず歯肉組織の血流を測定し、その後ラットを処刑し、歯肉組織に対して遺伝子発現分析と組織学検査を行った。

〈結果〉糖尿病ラット対照側の歯肉血流は正常ラット対照側より有意に低かった、正常ラットであれ糖尿病ラットであれ、歯周炎誘導後の歯肉組織血流はそれぞれの対照側より有意に増加した。遺伝子発現解析により、正常ラットにおいて、歯周炎誘導後TNF-α遺伝子発現は増加傾向にあるが、統計学的な違いはなく、iNOS遺伝子発現が顕著に増加した、糖尿病ラットにおいて、歯周炎誘導後TNF-αとiNOS遺伝子発現はいずれも顕著に増加した。組織学的検査により、正常ラットの歯周炎誘導部位は軽度炎症細胞浸潤のみを認め、糖尿病ラットのこの部位は顕著な炎症細胞浸潤を認めた。さらに歯肉組織中のニトロチロシンの発現を分析すると、正常ラットの歯周炎誘導部位にニトロチロシン陽性細胞が見られたが、糖尿病ラットは歯周炎誘導後、ニトロチロシン陽性細胞数が顕著に増加した。

〈結論〉本研究により、糖尿病ラットの実験側歯肉組織中のニトロチロシン陽性細胞数は顕著に増加し、糖尿病が歯周病を合併する過程でニトロソストレスが重要な役割を果たすことを示唆した、同時に、ニトロソストレスの抑制は糖尿病関連歯周炎の治療戦略の一つになる可能性があることを示唆した。

実験材料と機器

（一）実験材料

1. 実験動物：5 周齢雄SDラット匹

2. 糖尿病誘導剤：ストレプトゾバクチン（STZ）；歯周病誘導材料：ナイロン縫合糸（3-0スールクアラルンプール）；麻酔薬：（ペントバルビタル）

（二）実験機器

1. オメガウェイブ FLO-N1型レーザドップラー血流計、歯肉組織血流の測定に用いられる

オメガウェイブ FLO-N1型レーザドップラー血流計

歯肉組織中の血流値

2. リアルタイム蛍光定量PCR儀：遺伝子発現定量分析

3. 光学顕微鏡：組織切片染色後の観察と細胞計数用

4. 低温貯蔵設備：液体窒素タンク（組織急速冷凍用）、-80℃冷蔵庫（組織長期保存用）

5. 加熱マット：歯肉血流を測定する際にラットの直腸温度を37℃

じっけんてじゅん

（一）実験動物飼育と糖尿病モデルの構築

1. すべてSDラットは恒温で飼育されている（23±1.0℃）、恒湿（45±10%）の動物室を設置し、12 時間明暗交互周期、自動給水装置による水道水の供給。

2. ラット腹腔への注射STZ（60mg/kg）を用いて糖尿病を誘導し、STZしゃしゅつ1 週後にラット血糖値を測定し、血糖値を≥200mg/dLのラットを糖尿病モデルラットと判定し、後続実験に組み入れた。

（二）実験的歯周炎誘導

STZしゃしゅつ2 週後、すべてのラット（正常ラット+糖尿病ラット）の処置：（0.5mg/kg、腹腔注射）麻酔下、上顎右側第二臼歯（M2 の）歯首部にナイロン縫合糸（3-0スールクアラルンプール）、できるだけ歯肉を損傷しないようにして、近心口蓋に結び付けて固定する（この側は実験側）、上顎左側第二臼歯は処置しなかった（対照側）。

（三）歯肉組織血流測定

1. 歯周炎誘導後、腹腔注射（0.5mg/kg）ラットを麻酔し、レーザードップラー血流計（FLO-N1型）プローブを実験側と対照側に固定するM2 のの頬側歯茎の真上にあります。

2. 測定中、ラットを25℃直腸温度を維持するためにマットを加熱する37℃、血流値（単位：ml/min/100g組織）。

（四）組織収集と処理

1. 実験的歯周炎誘導 2 週後、腹腔内注射（1.5mg/kg）ラットを処刑した。

2. 採取実験側と対照側M2 のの頬側歯肉組織：一部は直ちに液体窒素を入れて急速に冷凍し、その後- 80℃冷蔵庫保存（遺伝子発現解析用）、もう一部を両側上顎組織ごと取り外し、入れる10%ホルマリン溶液固定24 時間（組織学的解析用）。

（五）遺伝子発現解析

1. 用いるTRIzol 試薬冷凍歯肉組織から抽出した総RNA の、さらにRNA のテンプレートとしてスーパースクリプトRNase H-Reverse Transcriptase合成cDNA。

2. 採用TaqMan ユニバーサル PCR マスター ミックスとタクマンプローブABI プリズム 7000計器上で行うPCR反応する95℃ 1分、52℃ 1分、72℃ 30秒/秒40 個のサイクル。

3. 以GAPDH内参遺伝子のために、ΔΔCtはほうけいさんTNF-αとiNOS遺伝子の相対発現量。

実験的結論

本研究により、糖尿病ラットの実験側歯肉組織におけるニトロチロシン陽性細胞数は顕著に増加し、糖尿病が歯周病を合併する過程において、ニトロソストレスが重要な役割を果たすことを示唆した、同時に、ニトロソストレスの抑制は糖尿病関連歯周炎の治療戦略の一つになる可能性があることを示唆した。