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Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd
蛋白質キナーゼ阻害剤の選択的評価のための超深度リン酸化蛋白群学
日付：2025-08-26読み：0
蛋白リン酸化は真核細胞の普遍的な翻訳後修飾形式であり、細胞信号伝達、細胞過程及び蛋白質機能制御の面で重要な役割を果たしている。タンパク質リン酸化は、タンパク質キナーゼを介してアデノシン三リン酸（ATP）末端リン酸基を基質タンパク質のセリン、トレオニン、およびチロシン残基に移すことである。蛋白質キナーゼの遺伝子突然変異または異常発現はキナーゼの過剰活性化を引き起こし、それによって癌およびその他の疾病を引き起こす。そのため、プロテインキナーゼは最も重要な抗腫瘍薬の標的の1つとなっている。現在、世界で80種類以上のキナーゼ阻害剤（PKI）が発売されており、約180種類のPKIが臨床試験を行っている。それでもPKI薬物の開発は多くの挑戦に直面しており、特に標的選択性と脱標的毒性に直面している。現在、PKIの選択的評価は主に数百種類のクローン精製された蛋白質キナーゼ、または遺伝子組み換えにより標的キナーゼを高発現する細胞系に依存している。精製されたキナーゼは細胞環境から離脱するため、細胞内でのPKIの選択性を真実に反映できない、一方、トランスジェニック細胞の試験は、予め設定された標的キナーゼに限定される。この問題に対して、中国科学院上海有機化学研究所の生命過程小分子制御全国重点実験室康経武課題グループは超深リン酸化蛋白質グループ学方法を発展させ、細胞レベルと蛋白質グループ学層でPKI選択性に対する全面的な評価を実現した。
蛋白質リン酸化は高度な動的かつ低存在度の特徴がある（リン酸化蛋白質群は全蛋白質群の0.1%にすぎず、チロシンリン酸化蛋白質はリン酸化蛋白質群の0.1-1%にすぎない）ため、リン酸化ペプチド段の濃縮は質量分析の重要なステップとなる。PKIによるリン酸化事件を正確に測定するために、彼らが発展した一連のマイクロ全体親和カラム技術に基づいて（Anal Chem 2020、923913-3922、J Proteome Res 2023、222450-2459、Anal.Chem.2023、95、8605-8612）、3種類の選択的相補的なリン酸化ペプチドセグメント富化材料を集積する策略を提案し、リン酸化ペプチドセグメントの深さ全被覆と偏倚のない定量分析を実現した（図1）。
図1.超深度リン酸塩群解析フローチャートとリン酸塩群解析データプロファイル（クリックしてグラフを見る）
ゼブチニブをモデルとし、データ依存性特性スペクトル収集（DDA）データにおいて、25種類の蛋白質の25個のリン酸化部位のリン酸化レベルが顕著に上昇し、66種類の蛋白質の72個のリン酸化部位のリン酸化レベルが顕著に低下した（そのうちチロシンリン酸化の占有率は80.9%）、データ非依存性特性スペクトル収集（DIA）データにおいて、80種類のタンパク質を有する91個のリン酸化部位のリン酸化レベルが顕著に上昇し、167種類のタンパク質のリン酸化レベルが顕著に低下したことが検出された（ほとんどがセリン／トレオニンリン酸化部位）（図2）。
図2.超深度リン酸化蛋白群学的解析により、ゼブチニによるB細胞リンパ腫細胞のリン酸化事象の変化が明らかになった（クリックしてグラフを見る）
図3.ゼブチニブが阻害または活性化するプロテインキナーゼおよびその関与する細胞プロセス
（クリックしてグラフを見る）
生物情報学的富化分析により、BCRとFcR信号経路を抑制するほか、ゼブチニはB細胞アポトーシス、EGFR、ERBB、RPTK及びMAPKカスケードなどの信号経路を制御した（図3）。興味深いことに、彼らの研究によると、ゼブチニはBTKとその下流の複数の重要な信号経路を抑制しただけでなく、RAF 1、CBL、PTPN 11タンパク質のリン酸化レベルを引き上げ、さらにERK 1/2 MAPK媒介のBCR信号経路の負帰還制御を活性化し、BCR信号経路の上流で信号伝達を遮断した。文献に報告されているゼブチニの標的に比べて、彼らが発展した超深度のリン酸化タンパク質グループ学戦略は、生細胞レベルで、より豊富な作用標的（または脱標的）情報を高スループットで得ることができる。リン酸化事象を細胞信号経路にマッピングすることにより、ゼブチニの作用機序をパノラマ的に明らかにすることができる（図4）。
図4.超深度リン酸化蛋白群学により明らかになったゼブチニブの可能性のある分子薬理学的メカニズム（クリックして大図を見る）
要するに、超深度リン酸化蛋白群学的分析は高フラックス、高感度、高信頼性の方法で細胞レベルで蛋白質キナーゼ阻害剤の選択性を全面的に評価することができるだけでなく、薬物によるリン酸化カスケード反応を分析することによって、PKIのより精密な作用機序を明らかにすることができる。また、この技術は細胞生物学の信号伝達研究にも広く用いられる。中国科学院上海有機化学研究所博士課程生の張越氏は論文の第一著者であり、中国科学院上海有機化学研究所生物康経武研究員と上海科学技術大学グループ学分析プラットフォームのカク丕良研究員は共同通信著者である。サイマー飛科技有限公司のAstral分析へのご協力に感謝します。この仕事は国家自然科学基金委員会、中国科学院及び上海市科学委員会などのプロジェクト及び基金の援助を得た。