難トランスフェクション細胞の遺伝子送達に対して、シンガポール国立大学の学者は、米Genizer社のリポソーム押出器を用いたキメラ遺伝子送達システムを製造し、その成果をNanoscale誌に掲載した。原文のフルネーム：Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI

シンガポール国立大学の研究チームは本研究で、ミクロセル嚢胞技術（micro Cell Vesicle Technology mCVT）に基づく新規なキメラ型遺伝子送達プラットフォームシステムを紹介した。この遺伝子送達プラットフォームシステムは、細胞膜とカチオン脂質が融合したものであり、難トランスフェクション（hard-to-transfect HTT）細胞のトランスフェクション効率を向上させるために用いられる。微小細胞嚢胞の細胞膜成分は複合体細胞全体に特異性を与え、トランスフェクション過程における複合体細胞毒性を減少させ、カチオン脂質は遺伝物質との結合を担当し、同時にmCVTsに構造完全性を提供した。

背景（はいけい）

遺伝子送達は外来DNAを真核細胞に導入する過程である。例えば、基礎研究（例えば、薬物発見及び機能性タンパク質のメカニズム研究）及び臨床応用（例えば、遺伝子治療）において、細胞プロセスを変化させるために治療性又は機能性遺伝子を伝達する。有効な遺伝子トランスフェクションは、外来核酸を細胞にうまく導入するだけでなく、その後の細胞内での輸送と発現も必要である。これは、DNA分子自体が負の電荷を帯びているため、通常の形式では細胞内化されにくいため、挑戦的な任務である。そのため、人々は有効な遺伝子伝達システムの開発に大きな興味を持っている。過去数十年間、ウイルスベースの送達システムから非ウイルスベクターまで、多くのベクターシステムが探索されてきた。非ウイルス遺伝子送達ベクターのトランスフェクション効率は相対的に低いが、安全性と臨床受容度の面では、カチオン脂質系とポリマーベースプラットフォームが主な例であることが期待されている。表1は、現在一般的に使用されているトランスフェクション試薬または方法の主な長所と短所をまとめたものである。

理想的な非ウイルス遺伝子送達システムは、目的とする遺伝子の最大発現を確保するために、必要なDNA分子を特定の細胞型に効率的に送達することができ、細胞毒性が最小であるべきである。しかし、現在市販されているトランスフェクション試薬は、特にトランスフェクション困難（HTT）細胞のトランスフェクションに使用されている場合には、これらの基準には明らかに達していないことが知られている。

HTT細胞は通常、3 T 3−L 1（マウス前脂肪細胞）、U 937（ヒト単核細胞）、Jurkat（ヒトTリンパ細胞）、HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）などのような初代細胞、胚性幹細胞、およびいくつかの永久生化学細胞株を含む。市販の試薬を用いたHTT細胞のプラスミドトランスフェクションの効率は25%を超えないことが多いと統計されている。HTT細胞の外来物質やプラスミドへの吸収率が低い理由の一つは、その代謝活性が低いことである。さらに、これらの細胞は通常、使用されるトランスフェクション試薬による細胞外乱に非常に敏感であり、細胞毒性を引き起こし、最終的に細胞死を引き起こす可能性がある。

最近、細胞由来の送達システムが活性貨物分子を標的部位にある程度特異的に送達する可能性があることから、かなりの注目を集めている。実際、多くの研究では、単核細胞由来薬物送達システム（DDS）を用いて腫瘍に化学療法薬とプラスミドDNA（pDNA）を方位送達するか、赤血球由来DDSを用いて血液循環を延長し、血液細胞にpDNAを方位送達することが探索されている。母体細胞を保持する細胞膜成分は、これらの細胞ベース薬物送達システムに特定の標的細胞を識別する能力を与え、身体免疫システムの識別能力から逃れることによって促進される可能性があると推測されている。

重大な治療的意義があるにもかかわらず、これまで細胞に基づくDDSの遺伝子伝達におけるすべての潜在力は大きく開発されていない。解決すべき重要な課題には、細胞源のDDS（例えば外分泌体形態）の煩雑さと低スループット分離/生産プロセス、およびセカンダリ遺伝子搭載/複合技術が含まれる。そのため、これらのシステムは内在的な標的性に優れているように見えるが、収量とpDNA積載効率には大きな限界がある。そこで、これらの制限を克服するために、標的細胞の内化を増強するための細胞膜成分とカチオン脂質成分からなる新規なキメラ遺伝子送達システムを開発し、pDNAの装填を増強するための後者を開発することを提案した。

本研究では、カチオン性脂質と細胞膜との融合によって得られる新しい混合送達プラットフォームであるマイクロセル気泡技術（mCVTs）の開発について述べた。mCVTsを生産するために、まず低浸透水溶液で細胞を処理して、Gohらが記述したようにゴースト細胞（CG細胞質を細胞器細胞に持たない）を得た。低浸透溶液は、質膜の完全性を維持しながら細胞内の内容物を除去することができるように、質膜上に短い開口を形成する。異なる細胞から水媒体中に懸濁されたCGを用いて、乾燥したDOTAP脂質薄膜を水和し、その後、リポソーム押出器を用いて押出し、押出したDOTAP脂質体と類似した平均流体力学寸法とZeta電位のmCVTsを提供した。本研究では、mCVTsがプラスミドと複合し、標的細胞に内化され、細胞毒性が最小であることを証明した。興味深いことに、異なる細胞型から生成されたmCVTsをinvitroで比較すると、mCVTsが由来する細胞型に対して、それらは明らかに高いトランスフェクション効率を示した。

方法と結果

ゴースト細胞（CG無細胞質と細胞器細胞膜）を作製し、mCVTsの再現性と安全性を確保した。

方法と結果の略

mCVTsの生産と特徴分析。

リポソーム製造と同様に、脂質薄膜法を用いてmCVTsを製造した。DOTAP薄膜はCGと水和し、CGを包む大型多分子リポソームを形成する。この懸濁液は押出され、CG由来のスラリー膜はDOTAP脂質（図3（a）に示す）を含む。私たちのグループが以前に確立した方法によると、押出後、このように生成されたmCVTsは脂質とCG膜の融合からなることが証明された。一般に、mCVTのサイズ分布はリポソームと似ている。この方法の様々な細胞系におけるロバスト性と汎用性を証明するために、いくつかのHTT細胞（すなわち3 T 3−L 1）と非癌細胞（すなわちHEK 293とRAW 264.7）のような異なる細胞系からのCGを用いてmCVTsを作製した。図3 Bに示すように、各種mCVTsの流体力学的寸法とPDIは通常400ナノメートルの範囲内（PDI〜0.4）であり、同じ押出方法を用いて製造されたDOTAPリポソーム（PDI〜0.2）と類似している。図3 Cでは、異なる処方で類似のゼータ電位値（約＋30 mVから＋40 mV）が観察され、この方法が異なる細胞系から生成されるCGに一般的に適用されることを示している。興味深いことに、mCVT 3 T 3−L 1がpDNAと複合した場合、その大きさ分布は未複合のmCVTsと類似し、全体のゼータ電位は負の値になり、これは複合が成功したことを示している（負に帯電したpDNAが正に帯電したmCVTsを中和させるため）。

A.mCVTsの概略図であり、細胞ゴーストと水和薄膜から作られたリポソームの融合に関する。

B.異なるmCVTs及びプラスミドを有するmCVT 3 T 3−L 1の水力寸法はDOTAPリポソームと比較する。すべてのmCVTsのサイズは500ナノメートル未満である。

C.DOTAPリポソームと比較して、異なるmCVTsとプラスミドを有するmCVT 3 T 3−L 1のZeta電位。すべてのmCVTsのZeta電位は+30 mV以上であり、プラスミドDNA（5µg）を有するmCVT 3 T 3−L 1を除き、プラスミドDNAとの相互作用により負のZeta電位を示した。データは平均値±SD（n＝3）を表す。