浙江大学劉帥課題群は単成分カチオン脂質mRNA送達担体を開発し、静脈投与後に脾臓T細胞を標的とした

四成分脂質ナノ粒子（LNPs）市販されているCOVID-1 9 mRNAワクチンと大量のmRNA療法の臨床試験に広く応用されており、mRNAを肝臓と筋肉に伝達する上での有効性が証明されている。mRNA薬物の肝外標的分布は非肝器官に影響を与える複数の疾患の治療に大きな意義を持ち、特に脾臓とT細胞を標的とする特異的なmRNA送達は癌免疫治療と抗ウイルス免疫反応の誘導に注目される選択を提供した。

それでも、mRNA標的を肝外組織に送達することは、その応用開発を制限する重要な課題である。現在の脾標的技術はしばしばトランスフェクション効率または治療効果の低下を代価として、新しい送達担体を使用する場合、脾中のmRNA全体の発現量は肝臓よりも低い。

2024年4月18日、浙江大学薬学部の劉帥課題グループにAngewandte Chemie 国際版と題する記事を掲載した「One-Component Cationic Lipids for Systemic mRNA Delivery to Splenic T Cells」の研究論文を発表した。本研究では、パラアミンリッチカチオン脂質独立した単一成分担体体外及び体内でmRNAを効果的に送達する。また、これらのベクターは静脈投与後にmRNAを脾臓T細胞サブグループに効率的に送達するのに役立ち、免疫治療応用の巨大な潜在力を示した。この簡単な戦略は肝外mRNA送達におけるリポソームの効用を拡張し、LNP以外のベクター開発に新たな知見を提供し、正確なmRNA治療分野の発展をさらに推進する。

大多数の四成分LNP担体の重要な構成部分として、多数の三級アミン含有カチオン脂質を設計した大量の研究がある（An-R-T）、典型的にはアミン基とエポキシ類似体またはアクリレートにより合成される。エポキシ開環とMichael付加開始材料の反応温度とモル比を注意深く制御すると、第二級アミン基に富むカチオン性脂質が得られる（An-R-S）（図1B、1C）そして、この設計されたイオン化可能陽イオン脂質を単成分担持体として用いて陽イオン脂質/mRNAナノ粒子を調製した（CLNs）。

図1.単成分カチオン脂質担体の設計合成

体外スクリーニング実験によると、二級アミン富化カチオン性カチオン性脂質（AnEP-SとAn-Ac-S）強力なmRNA発現と最小の細胞毒性を媒介し、最適な候補薬は第三級アミン脂質よりも脂質を示す（An-EP-TとAn-Ac-T）4桁の転送効率が向上します。ALC−0315 LNPsと比較して、効率の良いTE−EP 10−S CLNsは43倍の増強を示した。

mRNAの結合／カプセル化において、第三級アミンリポソームは60%未満の低いmRNA結合率しか示さず、一方、単一二級アミン脂質のmRNA結合率は95%に達した（図2 D）。移液器によるCLNの製造サイズは比較的に大きく、マイクロフロー制御装置による粒子径の効果的な減少、最適な寸法は100nm左右。An-R-S脂質は第二級アミン基と疎水性尾部に富むため、mRNA静電作用と疎水作用に対してCLNsの安定性を保証し、4℃の10%ウシ胎児血清であっても（FBS）血清中で7日間インキュベートした後も、この設計下のCLNsは安定していた（図2 E）。

赤血球破裂による溶血の測定と蛍光共鳴によるエネルギー移動（FRET）分析した脂質融合分析により、2種類のアミンリッチ脂質間の内因性脱走には明らかな差はなかった（図2 G）共焦点蛍光イメージングにより、最適化された第二級アミンCLNsが内部体中から効果的に脱出することを確認した（図2 H）対照的に、第三級アミン対応ベクターは、細胞摂取が低いために限られた内体逃避を媒介する。これらの結果は、多種類の送達障害を克服するための単一成分イオン化カチオン脂質の突破を際立たせた。さらに、第2級アミン系CLNは、mRNA結合及び細胞取り込みを増強するため、第3級アミンより優れている。

図2.単成分カチオン脂質CLNの構造効果及び理化特性分析

C 57 BL/6マウスにおける0.25 mg/kg静脈内投与によるCLNsの器官標的性の更なる評価（図3 A）。主に肝臓を標的とするLNPsと異なり、単成分は陽イオン脂質をイオン化し、主に脾臓を標的とするmRNA発現を媒介することができる。

TE-EP 8-Sは2つの疎水性テール和パラアミンき、得られたCLNsは脾臓中で最も高いmRNA発現を得た（図3 B）。その媒介するルシフェラーゼ発現は脾臓中で数桁高く、用量依存性が増加した。

図3.単成分CLNsのinvivo mRNA送達

loxp−Cre組換えシステムを導入したAi 9マウスモデルは、Cre組換えタンパク質の存在下でtdTomatoの発現を誘導して転写終了シグナルボックスを削除することができる（カセット停止）実験により、Cre mRNAを搭載したTE-EP 8-S CLNsは脾臓中の蛋白発現を効果的に促進し、静脈内投与後、6%近くのT細胞がトランスフェクションされた（図4 B，C）。

図4.TE-EP 8-Scln介在脾臓T細胞mRNA翻訳

本研究で提案した単一成分陽イオン脂質は直接担体構築に用いられ、mRNA薬物別の送達選択が提供され、mRNAを肝外組織に送達する可能性がある。本文で提案した第二級アミンに基づく単成分担体方法は広範なカチオン脂質とポリマー担体に拡張でき、mRNA伝達技術と応用をさらに発展させるために新しい研究方向を開いた。