利用ポイントの作成LUNA-FX7™自動細胞計数器精子細胞評価の最適化

キーーワード：自動細胞計数器、画像に基づく精子細胞評価、細胞計数、生存率評価、二重染色

1 はじめに

精子細胞評価（精液分析とも呼ばれる）は、男性の生育潜在力を判断する上で重要な役割を果たしている。生育能力を直接測定する指標ではないが、男性の生育能力は人間の生育にも畜産の育種にも重要な影響を与えるため、精子細胞評価が注目されている。

現在、精子細胞の評価は、フローサイトメトリーと画像に基づく分析ツールによって行うことができる。ポイントLUNA-FX 7™自動細胞計数器などの自動化装置は、画像を用いて精子サンプルを迅速かつ容易に分析することができる。しかし、精子細胞は哺乳動物細胞の形態及び特性上の独特性に比べているため、分析パラメータを最適化し、適切な染料を選択する必要がある。

本研究ではSYBR 14、アクリジンオレンジ（AO）、ヨウ化プロピリジン（PI）などの蛍光染料を比較分析し、LUNA−FX 7への点形成を最適化した™精子細胞の評価能力。本研究は異なる染料組み合わせの有効性を評価し、精子細胞評価のパラメータ設定を最適化することを目的とする。

2 方法と材料

2.1 サンプル調製

牛の凍結精液サンプルを解凍し、緩衝液をPBSで置換した。試料の状況に応じて、精液試料を約1：20〜1：40の割合でPBS中に希釈した。

2.2 けいこうせんしょく

1.混合：

18μL PBS中の精子細胞

2μL混合緑色と赤色蛍光染料

2.37℃で10分間インキュベート

3.サンプルを適切なスライドにロードする

4.ポイントLUNA-FX 7を使用する™解析を行う

表1.ポイントLUNA-FX 7™アドバンストモードにおける精子細胞評価の最適化パラメータ設定

3 精子細胞評価を最適化するための細胞計数スキームと染料の組み合わせ

まとめ：SYBR 14/PIとAO/PIの二重染色は精子活力評価に適しているが、SYBR 14/PIはより優れている。

ポイントLUNA-FX 7™のデフォルトプロトコルは一般的な哺乳類細胞に対して最適化されているが、精子細胞評価には露出レベル、細胞サイズ、脱凝集感度などのパラメータを調整する必要がある。例えば、最小探索サイズを3µmから7µmに調整し、脱凝集感度を5から7に調整して検出性能を向上させた（表1）。また、SYBR 14/PI及びAO/PI染色の露光レベルは、それぞれGF 6及びRF 9に設定される。

その上で、SYBR 14/PIとAO/PI染色方法について比較分析を行った。精子細胞評価におけるSYBR 14／PI染色法の既知の有効性を考慮して、AO／PI染色法の表現に注目した。研究の結果、2つの染色方法は精子細胞の評価に使用できることが明らかになった（図1）。しかし、精子細胞染色におけるSYBR 14の適用性はAOより優れており、SYBR 14の化学特性がこの応用に適している可能性があることを示している。

図1.2つの異なる染料（SYBR 14／PIとAO／PI）で染色した精子細胞の蛍光画像。この組み合わせ画像は分析後の明場、緑光、赤光、マーキング画像を示している。標識画像は複合蛍光チャンネル画像であり、赤丸は死亡細胞を表し、緑色丸は生存細胞を表す。

4 結論

本研究により、SYBR 14/PIとAO/PI染色法はいずれも精子細胞の生存率を評価するために用いることができるが、SYBR 14/PIの表現はより優れていることが分かった。また、露光レベルおよびその他のパラメータの調整は、全体的な検出性能にとって重要である。LUNA-FX 7をポイント化しても™精子サンプルの最適化に特化しているわけではありませんが、推奨されているサンプル希釈比率とイメージング条件の最適化により、迅速で便利な精子細胞評価案を提供することができます。