細胞計数方法：計数板から全自動細胞計数器へ

多くの一般的な実験と検査には、科学者がまず細胞の数や密度を正確に計算する必要があります。これらの操作には、細胞継代などの簡単な細胞培養維持、およびqPCRなどの定量実験が含まれる。細胞計数は様々な方法で行うことができ、本文ではこれらの方法とその長所と短所を全面的に紹介する。

1 計数板/血球カウントそうち

血球を使うカウントそうちの場合は、まずアルコール70%とレンズペーパーで清掃カウントそうちを選択し、カバーガラスをカウンタボードに軽く置きます。カバーガラスを正しく配置すれば、ニュートン環現象（同心環状のカラーパターン）が観察できる。ピペットで細胞懸濁液の小部分を取り、ピペットを計数板の縁に置き、毛細管作用により懸濁液を計数室に流入させた。細胞活性を検出する必要がある場合は、細胞懸濁液中にテーブルブルーを1：1の割合で添加する前に混入しなければならない。

ヘマトクリットカウントそうち正確な細胞計数を得るための初期の方法であり、計数板には特殊なメッシュがある。通常、大格子は1ミリ×1ミリであり、さらに0.05ミリ×0.05ミリの小格子に分けられる。計数室のエッジは、カバーガラスをマーキングメッシュの0.1 mm上に固定し、既知の体積の領域を形成するように設計されている。

顕微鏡は計数室の一領域に焦点を当てた後、けいすうき細胞を計数する。通常は1平方ミリメートル（100ナノリットル）の領域を用い、4倍または10倍の対物レンズを用いて計数するが、具体的な選択は細胞サイズと懸濁液中の密度に依存する。このプロセスは通常、4つの異なる1平方ミリ領域で繰り返され、結果は平均値をとります。細胞活性を検出する場合は、膜が損傷しているため、死細胞がテトラブルーで青色に染色された生細胞と死細胞をそれぞれカウントしなければならない。

図1血細胞カウンタボードメッシュの概略図

長所と短所

手動カウントは予算を節約する方法ですが、最も時間がかかり煩雑です。人為的誤差のため、特に連続して複数回カウントする場合、信頼性は低い。また、頻繁なカウントは目の疲れを引き起こす可能性もあります。実験室がたまに計数するだけで、高精度を必要としない場合は、血球けいすうきいい選択ですね。しかし、頻繁にカウントしたり、精度を高めたり、高スループットの応用が必要な場合、この方法は不足しているように見える。さらに、手動計数では、サイズまたは形状に有意な差がない限り、懸濁液中の異なるタイプの細胞を区別することは困難である。

2 じどうさいぼうけいすうき

じどうさいぼうけいすうきは、手動でカウントする迅速で簡単で自動化された代替プログラムです。それらは血液細胞とけいすうき同じ原理で、既知の領域内で細胞を複数回計数し、平均値をとることによって操作を完了する。これらの装置は、テアブルーなどの染料排除法によって生細胞と死細胞を区別することもできる。じどうさいぼうけいすうき独立したデバイスであっても、コンピュータに接続して使用することもできます。ほとんどけいすうき細胞カウントを提供するほか、細胞サイズなどの情報を統計することもできる。

蛍光細胞数儀（例えばLuna-FL™ 二重蛍光細胞数儀）生細胞と死細胞を区別し、一般的な染色剤（例えば、アクリジンオレンジとヨウ化プロピリジン）を用いて細胞計数を行うことができる。これらのタイプの細胞数儀染料が細胞を明確に区別できるため、非細胞断片（例えば、初代細胞）によって汚染される可能性のある培養物中の細胞を計数することにも優れている。

長所と短所

自動けいすうき適した汎用の細胞計数と活性検出を行った。それは操作が簡単で、コストが低く、手動で計数する労働量を大幅に削減した。自動けいすうき正確で信頼性がありますが、形状が不規則で、非常に小さく、懸濁液が極めて希薄であるか、区別が必要な複数の細胞を含む場合には課題があります。ほとんどの細胞型と応用に対して、自動けいすうき効率的なカウントパフォーマンスを提供します。

3 コルターけいすうき

コルターけいすうき光学機器ではなく、マイクロチャネルの抵抗変化を測定することで細胞を計数する。細胞の抵抗は懸濁液電解質溶液より高く、細胞がチャネルを通過すると一時的に抵抗が増加し、この変化は細胞の大きさが増加するにつれて増加する。Coulterけいすうきの操作は自動けいすうきただし、使用する前にブランクテストを実行し、使用後に設備の洗浄を行う必要があります。

長所と短所

クルトけいすうき速度が速く、異なる大きさの細胞を正確に計数できるため、病院の血球計数によく用いられる。しかし、生きた細胞と死んだ細胞を区別することはできず、クラスターを形成した細胞を正確に計数することもできない。また、メンテナンス要件が高い。

4 フローサイトメータ

フローサイトメータは通常、標識された細胞内成分を検出する蛍光検出技術を備えた、より詳細な細胞分析に使用される。すべてのフローサイトメータで細胞計数ができるわけではありませんが、体積測定機能を備えたフローサイトメータは高度に正確な細胞計数を提供し、蛍光標識された抗体で細胞タイプを区別することができます。

長所と短所

フローサイトメータは機能が強いが、価格が高く、通常は$40,000から$100,000以上であるため、通常の細胞計数にはほとんど使用されない。

5 その他の細胞計数方法

スペクトル測定はたまに細胞密の推定に用いられる度です。細胞は混濁性を有するため、細胞密度が増加するにつれて、比色皿を透過する光線が減少する。しかし、分光計は細胞を直接計数せず、吸光度のみを測定し、懸濁液中の他の変数が吸光度に影響を与える可能性があるため、この方法は信頼できない。

培養法は別の計数方法であり、コロニーを形成する細胞（細菌など）にのみ適用される。細胞懸濁液を希釈してシャーレにスクライブした後、コロニー数を計数して原始懸濁液の細胞密度を計算した。しかし、コロニーの成長を待つ必要があるため、培養法は最も遅い方法である。

自動細胞計数器：より正確な計数はより良質な科学をもたらす

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