ヒト血管内皮成長因子A（VEGF-A）ELISAキット実験使用説明書

BS−9809ヒト血管内皮成長因子A（VEGF−A）ELISAキット

一、製品の概要

本キットは二抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ELISA）を採用し、ヒト血清、血漿、組織ホモジナイズ、細胞培養上清などのサンプル中のVEGF-A濃度の測定に専用する。科学研究用のみ。

二、キット組成

プリパックはミクロ多孔質プレートによって鄒：12細孔質×8条（96細孔質規格）または12細孔質×4条（48細孔質規格）、プリパックは抗VEGF-A捕捉抗体によって捕捉される。

標準品：凍結乾燥粉末は、標準品希釈液を再溶解した後に倍比希釈する必要がある（推奨濃度勾配：10、3.33、1.11、0.37、0.12、0.04、0 ng/mL）。

抗体-HRP鄒：ワサビペルオキシダーゼ標識の抗VEGF-A抗体を検出した。

洗浄緩衝液：20×濃縮液は、蒸留水で1：20に希釈する必要がある。

基質溶液：TMB発色液A/B、使用前1：1に混合し、15分以内に使い切る。

終止液：2 M溶液。

試料希釈液：高濃度試料を希釈するために使用する。

封板膜：2枚、温育時に微孔板を密封するために使用する。

三、実験原理

VEGF−Aはプリパック捕捉抗体と結合し、「抗体−抗原」複合体を形成する、HRP標識検出抗体を添加すると、「サンドイッチ構造」が形成される。洗浄により未結合物質を除去し、TMB基質に添加して発色（青色）し、液終止反応後に黄色になる。450 nm波長で吸光度（OD値）を測定し、濃度はOD値に比例した。

四、実験手順

サンプルの準備

血清/血漿：遠心分離により粒子状物質を除去し、溶血を避ける、2−8℃で≦48時間保存し、長期保存には−20℃/−80℃を必要とする（繰り返し凍結融解を避ける）。

細胞上清：遠心分離して上清を取り、高濃度プロテアーゼ剤の含有を避ける。

試薬の準備

洗浄液：洗浄液の室温結晶を濃縮する場合、40℃の水浴が溶解した後、1：20で希釈する。

標準品：再溶解後の倍比希釈、現在配合されている。

基質：TMB A/B液を1：1で混合し、光を避けて保存する。

操作フロー

試料添加：穴ごとに100μL標準品/サンプルを添加し、37℃で90分間インキュベートした。

洗浄：孔内の液体を乾燥させ、洗浄液に1分/回浸漬し、3回繰り返した。

検査抗体を加える：1ウェル当たり100μLのHRP標識抗体を添加し、37℃で60分間インキュベートした。

洗濯‌：同期フラッシュ2。

発色性：1ウェル当たり90μLのTMB基質を添加し、37℃で15〜20分間光を避けてインキュベートした。

終止鄒：穴ごとに100μL終止液を添加し、混合後30分以内にOD値を測定した。

結果の計算

標準品濃度（ng/mL）を横軸とし、OD値を縦軸として標準曲線を描く。

サンプルOD値代入曲線から濃度を計算し、希釈倍数を乗じた結果。

五、注意事項

試薬保存‌：試薬キットを使用していない場合は2-8℃で光を避けて保存し、有効期間は6ヶ月、再溶解標準品は分装凍結保存でき、繰り返し凍結融解を避けることができる。

サンプル処理：含まれるサンプルの使用を避け、HRP活性を防止する。

操作規範鄒：液を移す必要があり、気泡を避ける；洗濯に必要で、交差汚染を防止する。

安全防護：終止液は強酸を含み、手袋を着用して操作する必要がある。

六、予想結果

感度鄒：≦1.54 pg/mL（実際には明細書に準じる）。

測定範囲：典型的な範囲は3.12-200 pg/mLで、一部のキットは62.5-2000 pg/mLに拡張した。

繰り返し性：板内/板間変異係数はそれぞれ10%未満と15%未満である。

七、FAQ

Q‌：発色が浅すぎたり深すぎたりしますか？

A‌：サンプル希釈倍数またはインキュベーション時間の調整、基質の新鮮な配合を確保する。

Q‌：標準曲線の線形差？

A‌：再溶解操作を検査し、気泡を避ける、ピペットヘッドを交換してください。

注：以上は参考に供するだけで、本製品は科学研究に供するだけで、実際のデータとしてではなく、実験は厳格に説明に従ったり、技術教師に相談したりしなければならない。

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