要約：グルタミン酸棒桿菌によるグルコースの摂取は主にグルコースに対して高い親和性（Km=0.35 mM）を有するマンニトールリン酸転移酵素システム（PTS）によって行われる。低親和性（Ks＝11 mM）の非PTS摂取システムを用いているため、低親和性（Ks＝11 mM）の非PTS摂取システムを用いているため、PEP依存性のグルコース輸送活性に耐えることができる変異体（2 DG）と、グルコースを単一炭素源とエネルギー源とする培地上で成長することができるPEP依存性の欠如したグルコース輸送活性を選択した。異なる浸透圧の培地で成長すると、野生型細胞はグルコース消費速度及び比成長速度より低下する。これらの培養物の細胞を標準条件下で測定したところ、類似のPTS活性を示した。しかし、細胞が異なる浸透圧の緩衝液中に再懸濁すると、PTS活性は浸透圧と相関を示す。この抑制効果は、高浸透圧発酵培地で観察される糖の吸収と成長速度の低下の原因を説明することができる。しかし、非PTSグルコース輸送システムは培地浸透圧の影響を受けない。工業生産条件下でグルタミン酸蓄積培地の浸透圧が相応に増加するにつれて、糖輸送能力に対する類似の抑制が観察された。この現象により、比速度の低下は細胞維持のために消費される糖の割合が増加するとともに、製品の生産率の低下に伴うため、発酵プロセスが制限される。

キーワード：グルコース輸送、浸透圧グルタミン酸発酵グルタミン酸棒桿菌、

研究内容：

1、PTSグルコース摂取システムの活力に対する浸透圧の影響

浸透圧800 mOsmol/Kg以内のPTS活性は一定を維持し、その後浸透圧の上昇に伴いPTS活性は線形に低下した。浸透圧1900 mOsmol/KgでのPTS活性は最高時の15%に過ぎなかった。

2、浸透圧がグルタミン酸発酵に与える影響

グルタミン酸と二次代謝物の蓄積は培地浸透圧の顕著な増加を引き起こし、pH値を一定に維持するために、塩基（本例ではアンモニア）の添加は浸透圧の増加をさらに激化させた。この現象はグルタミン酸棒状桿菌温度感受性菌株2262において観察され、この菌株は高生成物濃度（グルタミン酸>85 g/L）を達成でき、浸透圧は2000 mOsmol・kg−1を超える。最初の数時間以内に糖の消費率を維持し、その後

漸減する。活性減弱がグルタミン酸蓄積による浸透圧増加に関連しているかどうかを調べるために、総糖摂取量に対するPTS活性の寄与、野生菌グルタミン酸棒状桿菌ATCC 17965で測定された寄与、すなわち4.5 mmol.g−1・h−1を測定した。グルタミン酸生産菌株では、総糖の摂取が速く、浸透酵素活性が高いことが示されている。非ストレス条件下で測定されたグルコース摂取速度は、グルタミン酸棒状桿菌2262中の浸透酵素が最大25%の総グルコース摂取量に寄与することを示している。PTS輸送システムのinvitro測定方法に従ってPTS活性に対する浸透ストレスの抑制影響を測定し、グルコース補給条件下（浸透酵素の寄与は無視できる）（低残留グルコース、すなわち2 g・l-1未満）で、グルコース消費量の低下は予測されたPTS活性の低下に非常に近いことが見られた（図3 a）。高濃度を維持するグルコース補給戦略（50 g・l-1）を採用すると、グルコース消費は浸透酵素活性と反応器中に存在するグルコースの同システムに対する飽和度が高いことに起因する可能性がある（図3 b）。この条件下で、高グルコース消費率による追加代謝物の早期出現例えば乳酸。

3、グルタミン酸収率への影響

培地中の浸透圧が増加すると、代謝活性が低下する結果の1つは、発酵終了時にグルタミン酸収量が著しく低下することである。グルコース消費率の低下はグルタミン酸収率の低下を引き起こし、これはCO 2に転化するグルコースの割合が増加したためである。生産段階全体でCO 2生産量はほぼ一定であり、これは糖分解代謝から細胞維持の需要を満たすための生化学エネルギーを得ることを示し、この需要は発酵タンク内のバイオマスに比例し、

したがって、糖比消費速度の低下は、使用する糖の割合を増加させる必要がある。グルタミン酸棒状桿菌の維持係数0.6 mmolグルコース/g細胞/hを用いて計算すると、細胞維持に必要なグルコースの割合はグルタミン酸生産の初期段階における総糖消費の15%から発酵後期浸透圧が最も高い場合の40%に増加した（図4）。発酵後期に観察されたグルタミン酸収率の低下は、維持ニーズの炭素代謝流の変化と一致した。代謝活性が低下している間に代謝酸素要求量が低下すると、酸素変化に応じて残糖濃度を制御することで、部分収率損失を回復する可能性がある。

4.ディスカッション

本文はグルタミン酸発酵後期の抑制と生成物蓄積と浸透環境の糖吸収能力に対する制御影響が直接関連していることを説明した。この現象は遺伝子発現レベルの変化によるものではなく、浸透ストレス条件下で輸送系の生化学活性が変化したためである。さらに、この効果は、浸透ストレスが除去されると、洗浄された細胞は糖を輸送する能力を回復することができるため、可逆的である。同様に、高浸透性緩衝液に再懸濁すると、正常に成長する細胞糖輸送能力も著しく低下する。浸透圧が増加するにつれて、この生理的効果は糖消費能力の低下と代謝速度の低下をもたらす。バイオマスを維持するためのエネルギー要件は一定であり、多くの場合、このような圧力に対抗するために追加のエネルギーを増加させる必要があるため、製品の生産性が低下する可能性もあります。ますます多くの糖消費はエネルギー生産に使われるため、製品を減らす代わりに二酸化炭素の形で失われる。グルタミン酸発酵では、培地浸透圧の増加に伴い、収量と収率が顕著に低下した。PTSタンパク質輸送能力の低下を引き起こす生化学的メカニズムはまだ決定されていないが、タンパク質/膜複合体の構造変化に関連している可能性がある。グルタミン酸をより効率的にまたはより迅速に生産する菌株は浸透閾値に達するのが速くなり、24時間発酵後に生産量が上がらない可能性がある。そのため、高耐圧能力を有する菌株をスクリーニングすることは発酵に有益であり、それによって工業菌株が十分に丈夫であり、高収量物の収量を得る際に高代謝活性を維持できることを確保する。この代謝抑制を克服するもう1つの経路は、下流抽出プロセスを統合して発酵蓄積時に生成物を除去することができる発酵システムを開発することである。